Identification and characterization of kazal-type serine proteinase inhibitors, SPIpm4 and SPIpm5, from haemocytes of black tiger shrimp penaeus monodon

การระบุและลักษณะสมบัติของตัวยั้บยั้งซีรีนโปรตีเนสชนิดคาซอล SPIpm4 และ SPIpm5 จากเซลล์เม็ดเลือดของกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon

Name: Suwattana Visetnan

LCSH: Serine proteinases -- Inhibitors

LCSH: Penaeus monodon

LCSH: Shrimps -- Diseases

Abstract: Serine proteinase inhibitors (SPIs) play important roles in physiological and immunological processes involving proteinases in all multicellular organisms. In black tiger shrimp P. monodon, nine different Kazal-type SPIs, namely SPIPm1-9, were identified from the cDNA libraries. The semi-quantitative RT-PCR of seven Kazal-type SPI genes after V. harveyi 639 challenge showed that the expression of SPIPm1 was significantly increased for 1.92 fold at 6 hpi. Other SPI genes: SPIPm2, 6, 7 and 9 showed hardly any differences in mRNA expression level. RT-PCR study of the SPIPm5 gene revealed that it was up-regulated in response to heat treatment. The SPIPm4 and SPIPm5 consist of open reading frames of 387 and 399 bp coding for polypeptides of 128 and 132 amino acids with putative signal peptides of 21 and 19 amino acid residues and mature SPIs of 107 and 113 amino acid residues, respectively. Recombinant expression in an E. coli expression system yielded recombinant proteins, rSPIPm4 and rSPIPm5, with molecular masses of 12.862 and 13.433 kDa, respectively. The SPIPm4 inhibitor exhibited potent inhibitory activity against subtilisin and SPIPm5 against subtilisin and elastase. The inhibition was a competitive type with inhibition constants (Ki) of 14.95 nM for SPIPm4 against subtilisin, 4.19 and 59.64 nM, respectively, for SPIPm5 against subtilisin and elastase. They had no bacteriostatic effect against B. subtilis, B. megaterium, S. aureus, V. harveyi 639 and E. coli JM109.

Abstract: ตัวยับยั้งซีรีนโปรตีเนสมีบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกัน และมีบทบาทสำคัญอย่างยิ่งในกระบวนการพื้นฐานต่างๆ ทางสรีรวิทยา พบในสิ่งมีชีวิตหลายชนิด จากข้อมูล EST ของกุ้งกุลาดำ พบว่า สามารถจัดจำแนกตัวยับยั้งซีรีนโปรตีเนสชนิดคาซอลได้ทั้งหมด 9 ชนิด คือ SPIPm1-9 การศึกษาระดับการแสดงออกของตัวยับยั้งซีรีนโปรตีเนสชนิดคาซอล 7 ชนิด ที่ถูกกระตุ้นด้วย V. harveyi 639 ด้วยวิธี semi-quantitative RT-PCR พบว่า ระดับการแสดงออกของยีน SPIPm1, 2, 6, 7 และ 9 ในระดับ mRNA ไม่เปลี่ยนแปลงหลังจากการกระตุ้น สำหรับการศึกษา RT-PCR ของ SPIPm5 แสดงให้เห็นว่าระดับการแสดงออกของ SPIPm5 เพิ่มขึ้น และตอบสนองต่อความร้อน ส่วน SPIPm4 และ 5 ประกอบด้วยบริเวณ open reading frame ขนาด 387 และ 399 เบส แปลรหัสให้โปรตีนที่มีกรดอะมิโนจำนวน 128 และ 132 ตัว ซึ่งรวมส่วน signal peptide 21 และ 19 เรสซิดิวส์ของกรดอะมิโน และได้โปรตีนสมบูรณ์ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโน 107 และ 113 หน่วย ตามลำดับ โปรตีนรีคอมบิแนท์ rSPIPm4 และ 5 ที่ผลิตได้จากระบบ E. coli มีขนาด 12.862 และ 13.433 กิโลดาลตัน จากการศึกษาแอกทิวิตีการยับยั้งโปรติเนส พบว่า SPIPm4 มีแอกทิวิตีในการยับยั้ง subtilisin ส่วน SPIPm5 มีแอกทิวิตีในการยับยั้ง subtilisin และ elastase ซึ่งชนิดของการยับยั้งเป็นแบบแข่งขัน โดย SPIPm4 มีค่าคงที่ในการยับยั้ง subtilisin เท่ากับ 14.95 nM และ SPIPm5 มีค่าคงที่ในการยับยั้ง subtilisin และ elastase เท่ากับ 4.19 และ 59.64 nM ตามลำดับ นอกจากนั้นพบว่า โปรตีนรีคอมบิแนนท์ของ SPIPm4 และ SPIPm5 ไม่มีฤทธิ์ทำลายแบคทีเรีย เมื่อทำการทดสอบด้วยเชื้อ B. subtilis, B. megaterium, S. aureus, V. harveyi 639 และ E. coli JM109

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Vichien Rimphanitchayakit

Role: advisor

Name: Anchalee Tassanakajon

Role: advisor

Created: 2009

Modified: 2560-11-09

Issued: 2014-03-09

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Suwattana_Vi.pdf	2.82 MB	1	2018-06-01 05:00:38

ใช้เวลา

0.021662 วินาที