Development of multiplex PCR for simultaneous detection of staphylococcus aureus bacillus cereus and salmonella spp in food samples

การพัฒนาวิธีมัลติเพล็คพีซีอาร์ในการตรวจหาเชื้อสแตฟีโลค็อคคัส ออเรียส เชื้อบาซีลัส ซีเรียสและเชื้อกลุ่มซาลโมแนลลาในคราวเดียวในตัวอย่างอาหาร

Name: Patcharawalai Wassanarungroj

MeSH: Bacillus cereus

MeSH: Salmonella

MeSH: Staphylococcus aureus

LCSH: Foodborne diseases -- Molecular diagnosis

LCSH: Polymerase chain reaction

Abstract: Food-borne pathogens remain a major public health concern worldwide. Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and Salmonella spp. are considered as the major food-borne pathogens of human gastroenteritis and often cause contamination in meat and food products. Rapid methods for detecting and identifying Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and Salmonella spp. are required for consumer protection. In this study, multiplex PCR method was developed for simultaneous detection of these three pathogens in food samples. The target genes in this study were enterotoxin A (sea) gene of S. aureus, invasion (invA) gene of Salmonella spp. and non-haemolytic A (nheA) gene of B. cereus. Multiplex PCR was developed using three pairs of synthetic oligonucleotide primers and molecular sizes of the expected amplicons from sea, invA, and nheA genes, were approximately 263- bp, 463-bp, and 757-bp for S. aureus, Salmonella spp., and B. cereus, respectively. For rapid detection of the three food-borne pathogens, three methods for sample preparations using whole cells, heat-treated cell lysates, and genomic DNA extraction kits were compared. There were no significant differences in sensitivity between samples prepared by the three methods. The results showed that the detection limit of this newly developed method for these three pathogens in pure culture was estimated at 102-105 CFU/ml or 100-103 CFU/PCR reaction and about 105-107 CFU/ml or 103-105 CFU/PCR reaction in artificially inoculated food samples. The organism identification followed the standard protocol that is recommended by the Bacteriological Analytical Manual with some modifications and was comparable to the PCR result. The whole procedure was easily completed within 28 h in food samples. The developed multiplex PCR method was quicker, simpler, and less laborious than the conventional culture method. The multiplex PCR is appropriate for use in presumptive and simultaneous screening of these three food-borne pathogens in large-scale samples of raw meat for industries and consumers.

Abstract: เชื้อก่อโรคในระบบทางเดินอาหารเป็นปัญหาหลักเกี่ยวกับสุขภาพของประชาชน เชื้อ S. aureus เชื้อ B. cereus และเชื้อ Salmonella spp. เป็นเชื้อที่พบบ่อยทำให้เกิดโรคในระบบทาง เดินอาหารของมนุษย์ วิธีตรวจที่รวดเร็วสำหรับตรวจหาและจำแนกเชื้อ S. aureus เชื้อ B. cereus และเชื้อ Salmonella spp. เป็นที่ต้องการเพื่อความปลอดภัยของผู้บริโภค วีธีมัลติเพล็คพีซีอาร์ถูก พัฒนาขึ้นเพื่อตรวจหาเชื้อทั้ง 3 ชนิดในตัวอย่างที่ทดสอบในคราวเดียวกัน ยีนเป้าหมายที่ใช้ในการ ศึกษานี้คือ ยีนของเชื้อ S. aureus สายพันธุ์ที่สร้างสารพิษชนิด A (sea) ยีนส่วน invasion gene (invA) ของเชื้อ Salmonella spp. และยีนที่สร้าง enterotoxin ชนิด non-haemolytic A (nheA) ของเชื้อ B. cereus วีธีมัลติเพล็คพีซีอาร์ ได้พัฒนาขึ้นโดยใช้ primers ทั้งหมด 3 คู่ และผลการ ตรวจยีน sea ยีน invA และยีน nheA ที่ต้องการมีขนาดประมาณ 263 bp (S. aureus) , 463 bp (Salmonella spp.) และ 757 bp (B. cereus) ตามลำดับ การตรวจหาเชื้อทั้ง 3 ชนิดที่รวดเร็วนั้น ได้เปรียบเทียบวิธีการสกัด DNA จากตัวอย่างทั้งหมด 3 วิธีคือการใช้โดยตรง (whole cells) การ ใช้ความร้อน (heat-treated cell lysates) และสกัดด้วยวิธีบริสุทธิ์ (genomic DNA extracts) เพื่อดูความไวของแต่ละวิธี และพบว่าทั้ง 3 วิธีมีความไวไม่แตกต่างกัน จากการศึกษาพบว่าปริมาณ เชื้อต่ำสุดที่ตรวจได้คือ 102-105 CFU/ml หรือ 100-103 CFU/PCR reaction สำหรับเชื้อบริสุทธิ์ และที่ 105-107 CFU/ml หรือ103-105 CFU/PCR reaction สำหรับตัวอย่างอาหารที่ใส่เชื้อ ทดสอบที่ทราบปริมาณ การตรวจการปน เปื้อนของเชื้อทั้ง 3 ชนิดตามวิธีมาตรฐานใน the Bacteriological Analytical Manual โดยปรับให้เหมาะสมและเปรียบเทียบผลที่ได้กับวิธี PCR โดยเวลาเพียง 28 ชม.ก็ตรวจหาการปนเปื้อนของเชื้อทั้ง 3 ชนิดในตัวอย่างได้ วีธีมัลติเพล็คพีซีอาร์ที่ พัฒนาขึ้นนี้มีความสะดวก รวด เร็ว ตรวจง่ายและใช้แรงงานน้อยกว่าวิธีมาตรฐานทางจุลชีววิทยา ดังนั้นจึงมีความเหมาะสมสำหรับตรวจการปนเปื้อนของเชื้อทั้ง 3 ชนิดในอุตสาหกรรมที่มีตัวอย่าง จำนวนมากและสำหรับผู้บริโภค

Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Mullika T Chomnawang

Role: Thesis Advisors

Created: 2007

Modified: 2553-08-24

Issued: 2010-07-24

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH P294d 2007

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biopharmaceutical Sciences

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4636351.pdf	2.85 MB	120	2020-01-16 11:23:30

ใช้เวลา

-0.691259 วินาที