Preparation and characterization of recombinant Plp B protein from Pasteurella multocida A:1

การเตรียมและการศึกษาเอกลักษณ์ของรีคอมบิแนนท์โปรตีน Plp B จากเชื้อ Pasteurella multocida A:1

Name: Jaran Nabnuengsap

MeSH: Poultry Diseases

MeSH: Vaccines Subunit

LCSH: Pasteurella multocida

LCSH: Recombinant proteins

Abstract: Pasteurella multocida is a gram-negative bacterial pathogen known to affect a wide range of domestic and wild animals. The increasing incidence of P. multocida isolated from cases of fowl cholera and hemorrhagic septicemia in most parts of the world has led to a renewed interest in this pathogen as well as in the development of vaccines. The currently available vaccines, bacterins and modified live vaccines, have limited efficacy. P. multocida has been demonstrated to express an antigen that induces cross protection against different serotypes. The purified cross-protective antigen of P. multocida was consistent with the plpB gene listed in the National Center for Biotechnology Information database for P. multocida. In this study, the PCR primers were designed based on the nucleotide sequence of P. multocida, Pm70 which was already published and used to amplify the fragment of plpB gene from P. multocida A:1 (FC-Pakchong). The plpB gene could also be detected in P. multocida NIAH DU1551/97 (A:1) and P. multocida NIAH D1275/27 (A:3,4); that were most associated with fowl cholera. The plpB gene, consisting of 831 base pairs was cloned and expressed. The purified PCR product was inserted into the pGEX-5X-1 plasmid which was carrying a gene encoding for GST protein. The expression of recombinant GST-tagged PlpB fusion protein in Escherichia coli was detected by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and purified by immobilized glutathione affinity column chromatography. The purified recombinant GST-PlpB fusion protein showed a major band migrated at about 63 kDa on SDS-PAGE gel which was an approximate size of the fusion protein. (After cleavage by factor Xa, GST tag was cleaved. The separated protein was presented at about 36 kDa.) Three concentrations of recombinant GST-PlpB fusion protein (50, 100, and 200 μg) were tested for the toxicity in mice. The results showed no toxicity in mice at the highest tested concentration (200 μg) of the protein. Thus, the recombinant GST-PlpB fusion protein, successfully cloned and expressed in this study, has a potential to be further developed as a subunit vaccine against P. multocida infection

Abstract: เชื้อ Pasteurella multocida เป็นเชื้อแกรมลบที่ก่อโรคในสัตว์เลี้ยงและสัตว์ป่าหลายชนิด จากอุบัติการณ์ที่เพิ่มขึ้นในการตรวจพบเชื้อ P. multocida ที่แยกได้จากสัตว์ที่ป่วยจากโรคอหิวาต์ สัตว์ปีก และ hemorrhagic septicemia ทำให้เชื้อชนิดนี้ได้รับความสนใจอีกครั้งในการศึกษาและ พัฒนาวัคซีน วัคซีนที่มีใช้ในปัจจุบัน ประกอบด้วยวัคซีนชนิดเชื้อตายและวัคซีนเชื้อเป็นที่ถูกทำให้ สิ้นความเป็นพิษ ซึ่งวัคซีนทั้งสองชนิดนั้นมีประสิทธิภาพที่ไม่สูงนัก ในการศึกษานี้ได้ออกแบบ PCR primer โดยอาศัยลำดับเบสของเชื้อ P. multocida สายพันธุ์ Pm70 ที่มีการตีพิมพ์เผยแพร่ไว้ เพื่อเพิ่มจำนวนชิ้นยีน plpB จากเชื้อ P. multocida A:1 (FC-Pakchong) ซึ่งเป็นสายพันธุ์ที่ใช้ใน การทำวัคซีน ยีน plpB อีกทั้งยังได้ตรวจพบยีน plpB ในเชื้อ P. multocida NIAH DU1551/97 (A:1) และ P. multocida NIAH D1275/27 (A:3,4) ยีน plpB ขนาด 831 คู่เบส ถูกเพิ่มจำนวน และเหนี่ยวนำให้แสดงออก ยีน plpB ที่ได้จาก PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์และแทรกลงในพลาสมิด pGEX-5X-1 โดยเชื่อมกับยีนของโปรตีน GST รีคอมบิแนนท์โปรตีน GST-PlpB ใน E. coli ที่ ผลิตขึ้น ถูกวิเคราะห์โดย sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) และทำให้มีความบริสุทธิ์โดยใช้ affinity chromatography จากการวิเคราะห์โดย SDS-PAGE พบว่ารีคอมบิแนนท์โปรตีน GST-PlpB ที่ได้มีขนาดประมาณ 63 kDa ซึ่งตรงกับ ขนาดของโปรตีนดังกล่าวที่ได้จากการคำนวณ (หลังจากตัดแยกโปรตีนลูกผสมด้วยเอนไซม์ factor Xa พบว่าโปรตีนมีขนาดประมาณ 36 kDa) ในการทดสอบความเป็นพิษของรีคอมบิแนนท์โปรตีน GST-PlpB (50,100 และ 200 μg) ในหนูทดลองพบว่า ไม่มีความเป็นพิษที่ระดับความเข้มข้นของ โปรตีนสูงสุด (200 μg) จากการศึกษาพบว่า รีคอมบิแนนท์โปรตีน GST-PlpB น่าจะมีความ เป็นไปได้ในการนำไปพัฒนาเป็นวัคซีนประเภทหน่วยย่อยเพื่อป้องกันการติดเชื้อ P. multocida ต่อไปได้

Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Mullika T Chomnawang

Role: Thesis Advisors

Created: 2009

Modified: 2553-08-24

Issued: 2010-07-24

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH J37p 2007

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biopharmaceutical Sciences

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4636349.pdf	2.68 MB	25	2025-01-22 16:07:48

ใช้เวลา

0.431908 วินาที