Cloning and characterization of an endoglucanase gene encoding thermotolerant cellulolytic enzyme from Syncephalastrum racemosum isolated from Thailand

การโคลนและการศึกษาลักษณะของยีนเอนโดกลูคาเนสจากเชื้อราทนร้อน Syncephalastrum racemosum ที่แยกได้ในประเทศไทย

Name: Benjamaporn Wonganu

LCSH: Gene expression

LCSH: Molecular cloning

LCSH: Pichia pastoris

LCSH: Syncephalastrum racemosum

MeSH: Cellulase

Abstract: A locally-collected filamentous fungus, Syncephalastrum racemosum (BCC18080), produced high level thermotolerant cellulases. Specifically, over 50% cellulases activities remained after incubation at 80°C for an hour. Since one of the cellulolytic enzymes, endoglucanase, is a major enzyme produced by the fungus; therefore, in this study, it is of interest to clone and characterize the endoglucanase gene from BCC18080. First, optimal condition to induce cellulase was determined. Then, BCC18080 total RNA was isolated; degenerate RT-PCR and 3’- and 5’-RACEs were employed to obtain the full-length endoglucanase gene (1,020 nucleotides encoding 340 amino acids). NCBI-BLAST search showed BCC18080 endoglucanase belonged to glycosyl hydrolase family 45. The signal peptide of this gene was as predicted by SignalP and later confirmed by Nterminal sequencing, suggesting that amino acid residues 1 to 32 was the signal peptide. Recombinant clones with and without the leader sequence were expressed in P. pastoris. Expression of all integrants demonstrated that the active BCC18080 endoglucanase gene was successfully produced and secreted as a 55 kDa and a 30 kDa proteins. N-terminal sequencing suggested that the 55 kDa band was the mature protein while the 30 kDa band was the truncated protein of the larger band. Since the size of the BCC18080 endoglucanase (55 kDa) was larger than the calculated molecular mass, it may contain sugar moieties. Glycoprotein analysis showed that the 55 kDa protein was glycosylated; but not in the N-linked position, while the smaller protein was not glycosylated. All recombinant proteins showed optimal temperature at 70°C and optimal pH at 5-6. They also showed activity against carboxylmethylcellulose and retained more than 50% activity for 4 hours at 70°C. This suggested that thermostable endoglucanase was successfully produced from P. pastoris transformants. In addition, high Kcat and low apparent Km of these recombinant proteins indicated good properties of this enzyme against its substrate.

Abstract: เชื้อรา Syncephalastrum racemosum (BCC18080) ที่เก็บได้ในประเทศไทย สามารถ ผลิตเอนไซม์เซลลูเลสที่มีคุณสมบัติทนความร้อนได้ถึง 80 องศาเซลเซียส ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงมุ่งเน้นจะทำ การโคลนและศึกษาลักษณะของยีนเซลลูเลสจากเชื้อราตัวนี้โดยเฉพาะอย่างยิ่งยีนเอนโดกลูคาเนส ซึ่งเป็น เอนไซม์หลักในกลุ่มเอนไซม์ที่ย่อยเซลลูโลส งานวิจัยนี้จึงได้ทำการโคลน cDNA ของเอนไซม์เอนโดกลู คาเนสจากเชื้อ BCC18080 และศึกษาลักษณะของเอนไซม์ ในขั้นแรกเชื้อ BCC18080 ได้ถูกเหนี่ยวนำ ให้เกิดการสร้างเอนไซม์แล้วได้ถูกนำมาสกัด total RNA เพื่อนำมาสังเคราะห์ cDNA ด้วยวิธีการ RTPCR, 3’- และ 5’- RACEs ผลการศึกษาพบว่า cDNA ของเอนไซม์เอนโดกลูคาเนสให้ลำดับนิวคลี โอไทด์ 1,020 ตัว ซึ่งถอดรหัสเป็นลำดับอะมิโนได้ 340 ตัว เมื่อเปรียบเทียบในฐานข้อมูลพบว่า cDNA ของเอนไซม์เอนโดกลูคาเนส จัดอยู่ใน glycosyl hydrolase กลุ่มที่ 45 ตำแหน่งอะมิโนที่ 1 ถึง 33 เป็น ตำแหน่งของ signal peptide ผลการแสดงออกของ cDNA ของเอนไซม์เอนโดกลูคาเนสใน P. pastoris พบว่าเอนไซม์สามารถผลิตและหลั่งออกนอกเซลล์ในทั้งแบบที่มีและไม่มี leader sequence ในรูปของโปรตีน 2 ขนาดคือ 55 kDa และ 30 kDa ซึ่งผลวิเคราะห์ลำดับอะมิโนในส่วนปลาย N พบว่า โปรตีนขนาด 55 kDa เป็นโปรตีนสายสมบรูณ์ของเอนโดกลูคาเนส ในขณะที่ 30 kDa เป็นโปรตีนที่ถูก ย่อยไปบางส่วน นอกจากเอนไซม์ที่โคลนได้จะมีความจำเพาะเฉพาะกับซับสเตรสของเอนโดกลูคาเนสแล้ว เอนไซม์ยังสามารถทนต่อความร้อนได้ถึง 70 องศาเป็นเวลา 4 ชั่วโมงโดยที่ความสามารถในการทำงาน ยังคงอยู่มากกว่า 50 เปอร์เซ็นต์ แสดงให้เห็นว่า P. pastoris ที่มียีนที่สร้างเอนโดกลูคาเนสจาก BCC18080 สามารถผลิตเอนไซม์เอนโดกลูคาเนสที่สามารถทนต่อความร้อนสูงได้สำเร็จ มากไปกว่านั้น ค่า Kcat ที่สูงและค่า Km ที่ต่ำ เป็นค่าที่แสดงให้เห็นว่าเอนไซม์เอนโดกลูคาเนสจากเชื้อราที่ศึกษาสามารถ จับและย่อยกับซับสเตรสที่จำเพาะเจาะจงกับเอนไซม์ได้ดี

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Kusol Pootanakit

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-26

Issued: 2010-06-01

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740470092

CallNumber: TH B468c 2006

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4636875.pdf	2.94 MB	14	2018-05-16 14:04:41

ใช้เวลา

0.29285 วินาที