Functional importance of the proline-rich motif and the disulphide bond in the a4-a5 loop of the Bacillus thuringiensis Cry4Aa toxin

หน้าที่ความสำคัญของ proline-rich motif และพันธะไดซัลไฟด์ในส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 ของโปรตีนสารพิษ Cry4Aa จากแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis

Name: Satita Tapaneeyakorn

LCSH: Mosquitoes -- control

LCSH: Toxins

LCSH: Bacillus thuringiensis

Abstract: Both the disulphide bond (Cys192-Cys199) and the proline-rich motif (Pro193ProAsnPro196) in the long loop connecting the α4-α5 transmembrane hairpin of the Cry4Aa mosquito-larvicidal protein have been found to be unique among the Bacillus thuringiensis Cry δ-endotoxins. In this study, the structural requirements for larvicidal activity of the Cry4Aa toxin were investigated. C199A/P193A, C199A/P194A and C199A/P196A mutant toxins were initially generated by using PCR-based mutagenesis and over-expressed in Escherichia coli cells as 130-kDa protoxins at levels comparable to the wild-type toxin. When E. coli cells expressing each mutant toxin were assayed for their toxicity against Aedes aegypti, an almost complete loss in larvicidal activity was observed for the C199A/P193A double mutant, whereas a small reduction in toxicity was shown for the C199A/P194A and C199A/P196A mutants. Further mutagenic analysis of the PPNP motif revealed that increasing the flexibility of the α4-α5 loop through C199A/P193G, C199A/P194G/P196A, C199A/P194A/P196G and C199A/P194G/P196G mutations significantly decreased the larvicidal activity. Similar to the wild-type protoxin, all mutant toxins were structurally stable upon solubilisation and trypsin activation in carbonate buffer, pH 9.0. These findings suggested that both the proline-rich motif and the unique disulphide bridge play a structural function of the α4-α5 loop in larvicidal activity of the Cry4Aa toxin.

Abstract: ส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 ของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุง Cry4Aa มีลักษณะเป็น เอกลักษณ์เฉพาะตัว คือประกอบด้วย proline-rich motif และพันธะไดซัลไฟด์ งานวิจัยนี้ได้ศึกษา ความสำคัญเชิงโครงสร้างของลักษณะเฉพาะในส่วนเชื่อมต่อดังกล่าว ที่มีผลต่อความเป็นพิษของ โปรตีนนี้ในการฆ่าลูกน้ำยุง ซึ่งได้เริ่มต้นด้วยการสร้างโปรตีนกลายพันธุ์ C199A/P193A, C199A/P194A และ C199A/P196A โดยอาศัยวิธีการเปลี่ยนแปลงยีนเฉพาะที่ด้วยเทคนิค ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) และพบว่าการแสดงออกเพื่อสร้างโปรตีนขนาด 130 กิโลดาล- ตันของโปรตีนกลายพันธุ์ทั้งสามชนิดใน E. coli นั้นเท่ากับของโปรตีนต้นแบบ (wild-type) ซึ่ง เมื่อนำไปทดสอบความสามารถในการฆ่าลูกน้ำยุงลาย Aedes agypti พบว่า E. coli ที่สร้างโปรตีน กลายพันธุ์ C199A/P193A ได้สูญเสียความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุงลาย ในขณะที่ E. coli ที่สร้าง โปรตีนกลายพันธุ์ C199A/P194A และ C199A/P196A สูญเสียความสามารถในการฆ่าลูกน้ำยุง เพียงเล็กน้อย เมื่อศึกษาเพิ่มเติมด้วยการเพิ่มความยืดหยุ่นของส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 โดยการแทนที่ proline ด้วย glycine ทั้งหมด 4 แบบ (C199A/P193G, C199A/P194G/P196A, C199A/P194A/P196G และ C199A/P194G/P196G) พบว่า โปรตีนกลายพันธุ์ทั้งสี่ชนิดทำให้ความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุงลดลง นอกจากนี้เมื่อนำโปรตีนกลายพันธุ์ ทั้งหมดมาทดสอบการละลายและการตัดย่อยด้วยเอนไซม์ trypsin ในสารละลายคาร์บอเนต pH 9.0 จะได้ชิ้นส่วนโปรตีนที่เสถียรเหมือนกับโปรตีนต้นแบบ จากการศึกษาครั้งนี้จึงเสนอได้ว่า ทั้ง proline-rich motif และพันธะไดซัลไฟด์ในส่วนเชื่อมต่อเกลียวอัลฟาที่ 4 และ 5 แสดงบทบาท ที่สำคัญเชิงโครงสร้าง ซึ่งมีผลต่อการออกฤทธิ์ฆ่าลูกน้ำยุงของโปรตีน Cry4Aa

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chanan Angsuthanasombat

Role: Thesis Advisors

Created: 2005

Modified: 2553-06-11

Issued: 2010-04-27

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740458467

CallNumber: TH S235f 2005

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4636858.pdf	3.2 MB	10	2019-01-31 14:30:17

ใช้เวลา

0.292053 วินาที