Induction of apoptosis in the absence of Caspase-3 by the Flavone VR-3623 in human breast cancer cell line

การเหนี่ยวนำให้เซลล์ตายแบบเอปอปโทซิสโดยไม่ต้องอาศัยเอนไซม์คาสเพส-3 โดยสารฟลาโวน-วีอาร์ 3623 ในเซลล์มะเร็งเต้านมคน

Name: Orawin Prangsaengtong

LCSH: Apoptosis

LCSH: Breas -- xCancer

Abstract: A growing body of epidemiologist studies have shown that increased flavonoid consumption such as tofu and soybean is associated with a reduced risk of breast cancer. In the present study, the mechanism of antiproliferative activity of VR- 3623 (5,3′-dihydroxy-3,6,7,8,4′-pentamethoxyflavone, DPMF) was investigated in human MCF-7 breast cancer cells in vitro. VR-3623 is a flavone compound isolated from the leaves and twigs of a Thai tropical plant, Gardenia obtusifolia. Treatment of MCF-7 cells with 4 concentrations, 0.8 μM (GI50), 2 μM (2.5×GI50), 4 μM (5×GI50) and 8 μM (10×GI50) of VR-3623 for 3-72 hours resulted in a dose-and time-dependent increased apoptotic cells as evaluated by 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage. After incubation with 8 μM VR-3623, the number of apoptotic cells characterized by chromatin condensation and DNA fragmentation after nuclear staining increased from 8% to the maximum level 66% as observed at 3 and 72 hours, respectively. In addition, Western blot analysis showed the expression of the proteolytic cleavage of PARP (85 kDa), an indicative sign of apoptotic cells, during 24-72 hours. To investigate the involvement of caspase enzyme in DPMF-mediated cell death, cells were preincubated with the general caspase inhibitor, Z-VAD-FMK (10 μM), 1 hour before the addition of 8 μM of the flavone. The results at 48 hours of incubation showed that the general caspase inhibitor could alleviate cell death by 13%, but completely prevent the cleavage of PARP. To further examine the caspases that contribute in DPMF-mediated apoptosis in caspse-3-deficient MCF-7 cells, caspase-9 and -7 activities in the apoptotic cells were determined using a fluorogenic assay. The findings showed that both caspases were activated and increased to the maximum levels at 48 hours after treatment, but the levels of activities were low throughout the experiments. The activity of both caspases was inhibited by 15 μM of their specific peptide inhibitors, Ac-LEHD-CHO for caspase-9 and Ac-DQTD-CHO for caspase-7. Furthermore, the release of cytochrome c and apoptosis-inducing factor (AIF) from the mitochondria into the cytosol was detected to see the role of mitochondria in this apoptosis. Western blot analysis demonstrated the expression of two proteins, cytochrmoe c (15 kDa) and AIF (57 kDa) at 24 hours and the maximum values at 48 hours after incubation. It is concluded that VR-3623 may suppress the growth of MCF-7 cells by induction of apoptosis through caspase-dependent pathway via caspase-7 activation and caspaseindependent pathway via AIF release. In addition, caspase-3 may not be essential in DPMF-induced apoptosis in caspase-3-deficient MCF-7 cells

Abstract: ปัจจุบันได้มีรายงานทางระบาดวิทยา แสดงถึงความสัมพันธ์ของการบริโภคสารประเภท ฟลาโวนอยที่ พบในเต้าหู้และถั่วเหลือง กับการลดอัตราของการเกิดโรคมะเร็งเต้านมเป็นจำนวนมากขึ้น การทดลองในครั้งนี้ เพื่อมุ่งศึกษากลไกของสารวีอาร์-3623 ที่มีผลต่อการยับยั้งการแบ่งตัวของเซลล์มะเร็งเต้านมของคน (MCF-7) สาร วีอาร์-3623 เป็นสารสกัดบริสุทธิ์ประเภทฟลาโวนที่แยกมาจากใบและกิ่งของพืชสมุนไพรไทยต้นการ์ดีเนีย ออบทู ซิโฟเลีย จากการศึกษาพบว่าเซลล์มะเร็งเต้านมที่ได้รับสารวีอาร์-3623 ที่ 4 ความเข้มข้น คือ 0.8, 2, 4 และ 8 ไม โครโมลาร์ (ซึ่งเป็นความเข้มข้นที่ GI50 2.5, 5 และ 10 เท่าของ GI50 ของสารวีอาร์-3623) เป็นเวลานาน 3-72 ชั่วโมง พบว่าเซลล์ MCF-7 ถูกเหนี่ยวนำให้ตายแบบอะพอพโตซิสมากขึ้นตามความเข้มข้น และ ระยะเวลาของ การทำการทดลอง ซึ่งลักษณะของเซลล์ที่ตายแบบอะพอพโตซิสสามารถประเมินได้จากการเปลี่ยนแปลงของ นิวเคลียสของเซลล์ด้วยการย้อมด้วยสารเรืองแสง DAPI (DAPI staining) และดูการเปลี่ยนแปลงทางชีวเคมีของ การถูกย่อยของเอนไซม์โพลีเอดีพี-ไรโบสโพลีเมอเรส (PARP) หลังจากที่เซลล์ได้รับสารวีอาร์-3623 ที่ความ เข้มข้น 8 ไมโครโมลาร์ พบว่าจำนวนเซลล์ที่ตายแบบอะพอพโตซิส มีเพิ่มมากขึ้น และเมื่อย้อมเซลล์ด้วยสารเรือง แสงแล้วจะเห็นเซลล์ที่มีสายโครมาตินรวมตัวกันแน่นและมีการแตกตัวเป็นชิ้นเล็ก ๆ ของดีเอนเอ ซึ่งมีจำนวน เพิ่มขึ้นจากร้อยละ 8 จนถึงระดับที่มากสุดที่ร้อยละ 66 ที่เวลา 3 และ 72 ชั่วโมงตามลำดับ นอกจากนี้การทำเวส เทอร์นบอรตพบชิ้นส่วนของ PARP ที่ถูกย่อยขนาด 85 kDa ในช่วงเวลา 24-72 ชั่วโมง ซึ่งบ่งชี้ถึงการเกิดอะพอพ โตซิส เนื่องมาจากเอนไซม์คาสเพสในช่วงเวลาดังกล่าวเพื่อศึกษาความเกี่ยวข้องของเอนไซม์คาสเพสกับการทำ ให้เกิดการตายของเซลล์โดยสารวีอาร์-3623 ได้ใส่ตัวยับยั้งเอนไซม์คาสเพสชนิดรวม (Z-VAD-FMK) ที่ความ เข้มข้น 10 ไมโครโมลาร์เป็นเวลา 1 ชั่วโมงก่อนที่เซลล์จะได้รับสารวีอาร์-3623 ที่ความเข้มข้น 8 ไมโครโมลาร์ พบว่าที่เวลา 48 ชั่วโมงตัวยับยั้งเอนไซม์คาสเพสชนิดรวมไปยับยั้งการตายของเซลล์ได้ร้อยละ 13 และสามารถ ยับยั้งการย่อยของ PARP ได้อย่างสมบูรณ์ จากการวัดระดับของเอนไซม์คาสเพส 9 และ 7 ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ถูก กระตุ้นผ่านการหลั่งของไซโตโครมซีจากไมโตครอนเดรียโดยใช้สารเรืองแสงพบว่าเอนไซม์ทั้งคู่ถูกกระตุ้นให้ สูงขึ้นและมีค่าเพิ่มมากสูงสุดที่ 48 ชั่วโมงหลังจากการได้รับสาร แต่ระดับของคลาสเพส 9 และ 7 มีปริมาณน้อย ตลอดการทดลอง และระดับของเอนไซม์คาสเพสทั้งคู่ถูกยับยั้งโดยตัวยับยั้งที่จำเพาะต่อชนิดของคาสเพสชนิดนั้น ๆ ที่ความเข้มข้น 15 ไมโครโมลาร์ จากการศึกษาการหลั่งของโปรตีนไซโตโครมซีและเอไอเอฟจากไมโตคอนเด รียสู่ไซโตพลาสซึมโดยการทำเวสเทอร์นบอรต พบว่าโปรตีนไซโตโครมซี (15 kDa) และเอไอเอฟ (57 kDa) ถูก หลั่งออกมาที่เวลา 24 ชั่วโมงและระดับของโปรตีนทั้งสองมีปริมาณเพิ่มมากที่สุดที่เวลา 48 ชั่วโมงหลังจากการ ได้รับสารวีอาร์-3623 จากข้อมูลทั้งหมดข้างต้นสรุปได้ว่าสารวีอาร์-3623 ยับยั้งการเจริญเติบโตของมะเร็งเต้านม ของคน (MCF-7) โดยเหนี่ยวนำให้เซลล์ตายแบบอะพอพโตซิสโดยผ่านเอนไซม์คลาสเพลส-7และสารเอไอเอฟ นอกจากนี้เอนไซม์คาสเพส-3 ไม่ใช่ปัจจัยที่สำคัญที่สารฟลาโวนตัวนี้ใช้ในการเหนี่ยวนำให้เกิดการตายแบบอะ พอพโตซิสในเซลล์มะเร็งเต้านม (MCF-7) คน

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Kulawee Sujarit

Role: Thesis Advisors

Created: 2005

Modified: 2553-03-29

Issued: 2010-03-02

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740455743

CallNumber: TH O63i 2005

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Physiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4336197.pdf	3.15 MB	50	2026-08-06 19:24:39

ใช้เวลา

-0.497719 วินาที