Characterization of a putative Drosophila XBP1 : a transcription factor regulated by unfolded protein response pathway ‪(UPR)‬

การศึกษาโปรตีน XBP1 ที่คาดว่าทำหน้าที่กระตุ้นการถอดรหัสของยีนซึ่งตอบสนองในกระบวนการ unfolded protein response ‪(UPR)‬ ในเซลล์แมลงหวี่

Name: Nongluk Plongthongkum

LCSH: Drosophila

LCSH: Endoplasmic reticulum

LCSH: Proteins -- Denaturation

Abstract: In response to the accumulation of unfolded protein in the endoplasmic reticulum (ER), eukaryotic cells activate an intracellular signaling pathway termed unfolded protein response (UPR) by increasing transcription induction of ER-resident proteins such as molecular chaperones and folding enzymes. A key step of this pathway is an unconventional splicing of X-box binding protein-1 (XBP1) mRNA encoding a basic leucine zipper (bZIP) transcription factor that activates the transcription of the UPR responsive genes. Interestingly, the unconventional splicing of the XBP1 mRNA results in a frame shift of its translation Open Reading Frame (ORF) downstream of the splicing junction. This leads to amino acid changes at the C-terminal region that exhibits higher transcriptional activation properties. Transcription induction of XBP1 mRNA during ER stress has been reported in various species as intermediate event of the UPR. In this study, we identified and characterized a putative XBP1 in insect cells using Drosophila melanogaster CRL 1963 as a model organism. RT-PCR analysis and DNA sequencing revealed the splicing of the potential 23 nt intron from the putative dXBP1 mRNA. Moreover, in vitro cleavage approach was employed to demonstrate that dXBP1 was specifically cleaved by hIre1αp IP in vitro at the predicted splicing junction. Unlike mammalian XBP1, transcription of dXBP1 itself is not induced during ER stress. Endogenous dXBP1 protein (from spliced dXBP1) was expressed exclusively in ER stress condition similar to those observed in mammalian species. Luciferase reporter assay was used to demonstrate that only dXBP1s functions as transcriptional activator to activate the UPR responsive genes through ERSE cis-acting element. This result supported the hypothesis that ER stress regulated splicing of intron from dXBP1 mRNA leading to production of a transcription factor is a mechanism to moderate insect UPR.

Abstract: สิ่งมีชีวิตพวกยูคาริโอตมีการตอบสนองต่อภาวะเครียดซึ่งเกิดจากการสะสมของโปรตีนที่ไม่ ม้วนพับในเอ็นโดพลาสมิคเรติคูลัม โดยการกระตุ้นการส่งสัญญาณที่เรียกว่า unfolded protein response (UPR) กระบวนการนี้นำไปสู่การเพิ่มการถอดรหัสของยีนสำหรับโปรตีนที่อยู่ในเอ็น โดพลาสมิคเรติคูลัม ขั้นตอนที่สำคัญในกระบวนการนี้คือ การตัดต่อนิวคลีโอไทด์บางช่วงอย่าง จำเพาะ ของ XBP1 mRNA ทำให้เกิดการเลื่อนลำดับของนิวคลีโอไทด์ที่ใช้ในการแปลรหัสที่ ตำแหน่งหลังบริเวณนิวคลีโอไทด์ที่ถูกตัด โปรตีนที่ถูกสร้างขึ้นนี้จัดอยู่ในประเภท bZIP ซึ่งทำ หน้าที่กระตุ้นการถอดรหัสของยีนที่ทำหน้าที่ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการการม้วนพับของโปรตีนใน เอนโดพลาสมิคเรติคูลัม จากการศึกษาในเซลล์ของมนุษย์ หนู และ หนอนตัวกลมพบว่า กระบวนการนี้ถูกควบคุมโดยตัวตอบรับ Ire1 ซึ่งทำหน้าที่ตัด mRNA ของ XBP1 อย่างจำเพาะ งานวิจัยนี้มีเป้าหมายเพื่อศึกษากระบวนการ UPR ในเซลล์แมลง โดยค้นหาและศึกษาโปรตีนที่ คาดว่าจะทำหน้าที่เป็น XBP1 ในเซลล์แมลงหวี่ XBP1 mRNA ที่คาดว่าจะเป็นสับเสตรทของ โปรตีน Ire1 ของเซลล์แมลงหวี่ถูกโคลนโดยวิธีการรีเวอร์ส ทรานคริปชัน พีซีอาร์ (RT-PCR) จาก เซลล์ถาวรสายพันธุ์ CRL 1963 ที่ถูกกระตุ้นให้เกิดภาวะเครียด เมื่อทำการอ่านลำดับของดีเอ็นเอ พบว่า 23 นิวคลีโอไทด์ถูกตัดออกจาก XBP1 mRNAอย่างจำเพาะ ทำให้ให้เกิดการเลื่อนลำดับของ นิวคลีโอไทด์ที่ใช้ในการแปลรหัสเช่นกันและปรากฏการณ์นี้จำเพาะต่อภาวะเครียดเท่านั้น นอกจากนั้นโดยวิธีการตัด XBP1 mRNA ของเซลล์แมลงหวี่ด้วยโปรตีน Ire1α ของเซลล์มนุษย์ ในหลอดทดลองแสดงให้เห็นว่า mRNA นี้ถูกตัดอย่างจำเพาะในบริเวณที่คาดไว้ จากการศึกษาใน เซลล์แมลงหวี่พบว่าการถอดรหัสโปรตีน XBP1 เกิดขึ้นในสภาวะเครียดเท่านั้นโดยถูกแปลรหัส จาก mRNA ที่ถูกตัดต่อเท่านั้น จากการศึกษาหน้าที่ของโปรตีน XBP1 ที่ถูกแปลรหัสจาก XBP1 mRNA สายปกติและสายที่ถูกตัด (XBP1u และ XBP1s ตามลำดับ)โดยวิธี luciferase reporter assay แสดงให้เห็นว่าเฉพาะ XBP1s ที่ทำหน้าที่เป็นตัวกระตุ้นการถอดรหัสของยีนเป้าหมายโดย การจับอย่างจำเพาะบริเวณ ER stress response element (ERSE) ผลการทดลองนี้สนับสนุน สมมติฐานที่ว่าการตัดอย่างจำเพาะของ XBP1 mRNA ทำให้เกิดการสร้างโปรตีนที่เป็นตัวกระตุ้น การถอดรหัส และเป็นกลไกหนึ่งซึ่งเซลล์แมลงใช้ตอบสนองในกระบวนการ UPR

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Witoon Tirasophon

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2553-03-20

Issued: 2010-02-19

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740453449

CallNumber: TH N812c 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536665.pdf	3.03 MB	34	2018-05-29 03:19:26

ใช้เวลา

0.297143 วินาที