Characterization of the subunit interface residues and their effects on enzyme properties of glutathione S-transferases

การศึกษาอิทธิพลของกรดอะมิโนในบริเวณรอยต่อระหว่างโมเลกุลที่ส่งผลกระทบต่อคุณสมบัติของเอนไซม์กลูตาไธโอน เอสทรานสเฟอเรส

Name: Juthamart Piromjitpong

LCSH: Glutathione transferase

LCSH: Proteins -- Denaturation

Abstract: The purpose of this research was to investigate the molecular basis for catalytic differences between closely related GSTs from the same class which have nucleotide and amino acid sequence similarities. Two closely related GSTs, namely adGSTD3-3 and adGSTD4-4, purified from Anopheles dirus, are of interest because they arise from alternate splicing and their crystal structures are available. These two isozymes have 68% amino acid identity and have very similar tertiary structures. Among 77 different amino acid residues in these two isozymes, there are nine residues at the subunit interface where the same residue position from both subunits fold to interact with each other. The interface interactions demonstrate three major areas; the conserved square electrostatic interactions at the top, the hydrophobic interactions at the center and the ionic interactions at the edge of the subunit interface. The results of the present work demonstrate that the conserved electrostatic interactions at the top of the subunit interface, which are formed by two glutamate75 and two arginine96 of adGSTD4-4, as well as the charge-charge network interactions at the edge of adGSTD4-4 subunit interface between glutamate116 and arginine134 are critical interactions that help to maintain the catalytic activity and conformation of the enzymes as shown by altering the kinetic parameters, refolding properties, thermal stability and florescence spectra. Moreover, we also observed that three variant hydrophobic amino acids at the center of the subunit interface influenced the specific properties of the adGSTD3-3 and adGSTD4-4. This was shown by amino acid replacement that changed the protein properties although the replacement did not differ much in amino acid properties; that is, tyrosine and phenylalanine, methionine and valine, and glycine and alanine. Although adGSTD3-3 and adGSTD4-4 are highly homologous proteins, they display non-identical conformational dynamics. AdGSTD3-3 is soluble in the unfolding solution and the unfolding occurs via four-state pathway (N2 I2 2I 2U) while adGSTD4-4 is aggregated in various concentrations of the unfolding solutions. Therefore, the unfolding pathway of adGSTD4-4 is still unknown. The native tertiary structures of adGSTD3-3 and adGSTD4-4 are similar as shown by similar tryptophan environments. However, their N2 subunit interfaces are not identical as reflected by their different fluorescent dye binding spectra and the electrostatic field and the solvent-exposed cleft at the subunit interface. The subunit interface of adGSTD4-4 showes less polarity and provides a greater amount of fluorescent dye binding sites when compared with adGSTD3-3. This feature may be a factor that influences the different folding dynamics of the two splicing products

Abstract: งานวิจัยนี้เป็นการศึกษาเอนไซม์กลูตาไธโอน เอสทรานสเฟอเรสในกลุ่มเดลตาสองชนิด คือ adGSTD3-3 และ adGSTD4-4 เอนไซม์ทั้งสองนี้ผลิตจากยีนเดียวกันแต่ให้รูปแบบของโปรตีนที่ แตกต่างกัน เมื่อเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนพบว่ามีความเหมือนกัน 68% และ มีความคล้ายคลึงกัน ในเชิงโครงสร้างสามมิติ แต่เมื่อเปรียบเทียบคุณสมบัติของเอนไซม์ทั้งด้านการเร่งปฏิกิริยาและ เสถียรภาพต่อความร้อนพบว่ามีความแตกต่างกัน จากการวิเคราะห์โครงสร้างสามมิติในบริเวณกึ่งกลาง ระหว่างรอยต่อของโมเลกุลที่ประกอบด้วยสองหน่วยย่อย พบว่าบริเวณดังกล่าวมีกรดอะมิโน 18 ตำแหน่งม้วนพับมาทำปฏิกิริยากัน การศึกษานี้ได้ทำการสร้างโปรตีนกลายพันธุ์โดยการเปลี่ยนแปลง กรดอะมิโนเฉพาะที่จำนวน 12 ชนิดเพื่อศึกษาอิทธิพลของกรดอะมิโนที่ตำแหน่งดังกล่าวต่อคุณสมบัติ ของเอนไซม์ พบว่าปฏิกิริยาไฟฟ้าทางสถิตย์ระหว่างอาร์จินีน96 และ กลูตาเมต75 และโครงข่าย ปฏิกิริยาไอออนิกระหว่างกลูตาเมต116 และอาร์จีนีน134 ที่บริเวณรอยต่อระหว่างโมเลกุลของ adGSTD4-4 มีความสำคัญต่อการเร่งปฏิกิริยาและการคงสภาพโครงสร้างของโปรตีน นอกจากนี้ยัง พบว่าความแตกต่างกันของกรดอะมิโนสามตำแหน่งที่มีคุณสมบัติไม่ชอบน้ำ(hydrophobic) ตรงบริเวณ กึ่งกลางของรอยต่อได้แก่ ไทโรซีน98 เมทไธโอนีน101 และไกลซีน102 ของ adGSTD3-3 และ ฟีนิลอะ ลานีน104 เวลีน107 และ อะลานีน108 ของ adGSTD4-4 มีบทบาทต่อคุณสมบัติที่จำเพาะเจาะจงของ โปรตีนทั้งสองชนิด ดังจะเห็นไดจ้ ากการที่คุณสมบัติของโปรตีนกลายพันธุ์ทั้ง 8 ชนิดเปลี่ยนไปทั้งด้าน การเร่งปฏิกริยาและโครงสร้างของโปรตีนเมื่อเปรียบเทียบกับโปรตีนต้นแบบ จากการศึกษาขั้นตอนการคลายตัว (unfolding pathway) ของเอนไซม์ทั้งสองรูปแบบ พบว่าการ เปลี่ยนแปลงโครงสร้างทางจลศาสตร์ของเอนไซม์ทั้งสองชนิดมีความแตกต่างกัน โดย adGSTD3-3 สามารถละลายได้ในสารละลาย GuHCl และคลายตัวโดยผ่านกระบวนการสี่ขั้นตอน (N2 I2 2I 2U) ในขณะที่ adGSTD4-4 ตกตะกอนในสารละลายดังกล่าว ทำให้ไม่สามารถวิเคราะห์ กระบวนการคลายตัวได้

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Ketterman, Albert J.

Role: Thesis Advisors

Created: 2004

Modified: 2010-05-18

Issued: 2010-02-17

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740451713

CallNumber: TH J96c 2004

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536667.pdf	13.79 MB	38	2018-05-29 03:13:19

ใช้เวลา

-0.73408 วินาที