Structure-activity relationship analysis of the putative pore-forming fragment of the Bacillus thuringiensis Cry4B delta-endotoxin

การศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและหน้าที่การทำงานของชิ้นส่วนก่อรูรั่วของโปรตีนสารพิษ Cry4B จากแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis

Name: Theeraporn Puntheeranurak

LCSH: Atomic force microscopy

LCSH: Bacillus thuringiensis

LCSH: Bilayer lipid membranes

LCSH: Endotoxins

Abstract: Bacillus thuringiensis δ-endotoxins are proposed to act by forming a lytic pore in the midgut cell membrane of susceptible insect larvae. The 130-kDa Cry4B toxin upon exposure to proteases in vitro is processed to protease-resistant products of ca. 47 kDa and ca. 21 kDa. The 21-kDa α1-α5 is a potential candidate for membrane insertion and pore formation. This study aimed therefore to express separately this putative pore-forming fragment (PPF) and to elucidate its possible role in isolation from the rest of the toxin. The cloned PPF fragment that was expressed in Escherichia coli showed itself to be capable of inducing liposome permeability and exhibited comparable activity to the full-length activated toxin. In addition, circular dichroism spectroscopy indicated that this fragment exists as an α-helical structure. The activated Cry4B toxin and the PPF fragment formed cation-selective channels in planar lipid bilayers and displayed fast kinetic activities. PPF channels remained always open and displayed multiple conductance levels. Mutagenesis effects on channel properties by alanine-substitution at Arg-158 in the PPF fragment were investigated. PPF-R158A mutant channels were observed to have similar characteristic as the wild-type PPF channels, except it took a longer incorporation time and also displayed more channel activities, suggesting that it has different oligomerization and dynamic properties inside the membrane. These results clearly show that the α1- α5 of Cry4B can function as an efficient pore-forming polypeptide without the remainder of the activated Cry4B toxin. By using atomic force microscopy, spontaneous insertion of 65-kDa activated Cry4B toxin in receptor-free lipid bilayers was observed, and that resulted in the formation of a pore-like structure, most likely with a tetrameric association of the toxin molecule

Abstract: โปรตีนสารพิษจากแบคทีเรีย Bacillus thuringiensis ออกฤทธิ์โดยการก่อรูรั่วที่ผนังหุ้ม เซลล์บุกระเพาะแมลงตัวอ่อน จากงานวิจัยที่ผ่านมาพบว่าโปรตีนสารพิษชนิด Cry4B ออกฤทธิ์ฆ่า ลูกน้ำยุงได้ และเมื่อตัดด้วยเอ็นไซน์ทริปซิน จะได้โปรตีนสองชิ้นย่อยที่อยู่ด้วยกันโดยมีขนาด ประมาณ 47 และ 21 กิโลดาลตัน โดยชิ้นส่วนเล็กหรือโปรตีนเกลียวอัลฟาที่ 1 ถึง 5 นั้นน่าจะเป็น ชิ้นส่วนที่ทำหน้าที่ในการสร้างรูรั่วบนผนังหุ้มเซลล์ งานวิจัยนี้ได้ทำการสร้างเฉพาะชิ้นส่วนโปร- ตีนเกลียวอัลฟาที่ 1 ถึง 5 โดยเรียกย่อว่า โปรตีน PPF เพื่อศึกษาหน้าที่และความสามารถในการ สร้างรูรั่วโดยไม่เกี่ยวข้องกับโปรตีนอีกส่วนหนึ่ง จากการวิจัยพบว่าโปรตีน PPF มีโครงสร้างโดย รวมเป็นเกลียวอัลฟาโดยการตรวจสอบด้วยวิธี circular dichroism spectroscopy สามารถทำให้ liposome เกิดการรั่วไหลได้ในระดับใกล้เคียงกับโปรตีน Cry4B และจากการทดสอบความ สามารถในการนำไฟฟ้าผ่านผนังเยื่อหุ้มจำลอง (planar lipid bilayers) นั้น พบว่าโปรตีนทั้งสอง ชนิดสามารถทำให้เกิดรูอิออนที่มีการนำไฟฟ้าจำเพาะต่ออิออนที่มีประจุบวก แต่ลักษณะของรูที่ เกิดจากโปรตีน PPF นั้นมีความแตกต่างคือ รูจะเปิดตลอดเวลา ซึ่งต่างจากโปรตีน Cry4B ที่มีการ ปิดและเปิดสลับกัน ในการศึกษานี้ยังได้ทำการสร้างโปรตีน PPF กลายพันธุ์ที่ตำแหน่ง Arg158 ในเกลียวอัลฟาที่ 4 เพื่อศึกษาผลกระทบต่อการสร้างรูรั่ว พบว่าโปรตีนดังกล่าวสามารถสร้างรูอิ ออนที่มีคุณสมบัติคล้ายกับรูที่เกิดจากโปรตีน PPF แต่ใช้เวลาในการเกิดรูมากกว่าโปรตีน PPF ซึ่ง อาจเกิดจากความแตกต่างในการรวมตัวของโมเลกุลเพื่อสร้างรูที่มีประสิทธิภาพ จากการศึกษานี้ จึง สรุปได้ว่า ชิ้นส่วน α1-α5 หรือชิ้นส่วนโปรตีน PPF สามารถทำหน้าที่ก่อรูรั่วได้เองอย่างมีประ สิทธิภาพ โดยปราศจากชิ้นส่วนอื่นของโปรตีนสารพิษ Cry4B และจากการศึกษาโดยใช้ atomic force microscopy เพื่อดูภาพการสร้างรูบนเยื่อหุ้มจำลอง พบว่าโปรตีนสารพิษ Cry4B สามารถ สอดแทรกเข้าไปในผนังเยื่อหุ้มได้ด้วยตัวเองและแต่ละรูที่เกิดขึ้นนั้นอาจเกิดจากการรวมตัวกันของ โปรตีนสารพิษจำนวน 4 โมเลกุล

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chanan Angsuthanasombat

Role: Thesis Advisors

Created: 2003

Modified: 2553-01-26

Issued: 2009-12-01

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740433561

CallNumber: TH T375sr 2003

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4136307.pdf	7.24 MB	12	2018-05-29 01:45:08

ใช้เวลา

0.259979 วินาที