Construction of HIV-1 CRF01-AE gp41/vaccinia recombinant virus for cytotoxic T lymphocyte assay

การสร้าง vaccinia recombinant virus ที่มี gp41 DNA insert สำหรับใช้ในการทดสอบ cytotoxic T lymphocyte assay

Name: Rungnapa Veeramano

MeSH: Vaccinia

MeSH: HIV Infections|xvirology

LCSH: HIV (Viruses)

Abstract: Vaccinia recombinant virus carrying foreign gene insert sequences derived from several infectious agents have been implicated in vaccine development or assays for humoral and/or cell-mediated immune response. The present study aimed to: 1) construct a vaccinia recombinant virus that contained HIV-1 gp41 DNA insert; and 2) apply this recombinant virus in the test for CTL (Cytotoxic T lymphocyte) activity against gp41 epitopes by classic 51Cr released bulk culture killing assay in HIV infected cases. HIV-1 strain DA5 CRF 01_ AE was used as the gene donor to provide gp41 DNA portion of the Env gene. The gp41 DNA was amplified and the PCR products were cloned into pGEM-T Easy plasmid, and subsequently introduced into E. coli competent cells to generate numerous copies of gp41 DNA. Subsequently, the purified gp41 DNA was inserted into pSC11, the expression plasmid vector designed especially for construction of vaccinia recombinant viruses. Then, gp41/pSC11 recombinant vector was used to transfect TK- cells that were pre-infected with the parental vaccinia virus, or wild-type vaccinia virus vaccine strain Lister. The HIV-1 gp41 DNA is integrated into vaccinia virus genome by the mechanism of homologous recombination. The recombinant virus was selected and purified by plaque purification technique; and an expression of gp41 DNA insert was determined by Western blot and indirect immunofluorescence. The constructed HIV-1 gp41/vaccinia recombinant virus was applied to CTL assay in HIV infected cases and compared with the other two recombinant vaccinia viruses containing whole gp160 Env gene insert: vP1536 (containing gp160 derived from HIV-1 CRF01_AE) and KPS-env (containing gp160 derived from HIV-1 strain DA5). The result showed that frequency of HIV infected cases who had CTL activity against gp160 were equal, as assayed either by one of the two HIV-1 gp160 recombinant viruses, i.e., 12 (63.2%) of 19 subjects tested were positive. However, only 6 (50%) of these 12 cases had CTL activity to gp41 domain. The study demonstrated the success in construction of HIV-1 gp41 recombinant vaccinia virus that could be successfully applied to CTL assay. This provides implications in the study on immune status in HIV infected cases and an evaluation of vaccine efficiency in an immune induction in the vaccinees. In addition, it can be applied as a source of gp41 protein screening antigen in monoclonal antibody research

Abstract: Vaccinia virus ซึ่งมียีนของเชื้อจุลชีพหลายชนิดอยู่ภายในยีโนม ถูกนำมาใช้ในการพัฒนาและการ ประเมินประสิทธิภาพของวัคซีน รวมทั้งการทดสอบระบบอิมมูนทั้งด้าน humoral immunity และ cellular immunity โครงงานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ 2 ประการคือ 1) สร้าง vaccinia recombinant virus ที่มี HIV-1 gp41 DNA insert และ 2) ใช้ vaccinia recombinant virus นี้ ในการทดสอบ CTL assay เพื่อวัด ความสามารถในการตอบสนองด้าน cellular immunity ต่อ gp41 ในผู้ติดเชื้อเอชไอวี โดยวิธี classic 51Cr released bulk culture killing assay HIV-1 gp41 DNA ถูกสร้างขึ้นโดยวิธี RT-PCR โดยใช้ส่วน gp41 ของ env gene จากเชื้อเอชไอวี CRF01_AE สายพันธุ์ DA5 เป็น DNA แม่แบบ จากนั้น gp41 DNA ถูกนำเข้าสู่ pGEM-T Easy plasmid ซึ่งเป็นยีนพาหะนำ gp41 DNA เข้าไปใน competent bacteria การเพิ่มจำนวนของแบคทีเรียทำให้ได้ DNA insert ปริมาณมาก, ซึ่ง DNA insert นี้จะถูกทำให้บริสุทธิ์และนำเข้าสู่ pSC11 ซึ่งเป็น expression plasmid vector ที่ถูกสร้างขึ้นมาโดยเฉพาะสำหรับการสร้าง vaccinia recombinant virus จากนั้นนำ gp41/pSC11 recombinant vector ไป transfect เข้าสู่ TK- cell ที่ติดเชื้อ vaccinia virus สายพันธุ์ Lister อยู่ก่อนแล้ว gp41 DNA จะแทรกเข้าไปในยีโนมของ vaccinia virus โดยขบวนการ homologous recombination เกิด เป็น HIV-1 gp41 vaccinia recombinant virus จากนั้นจะทำการคัดเลือก vaccinia recombinant virus โดยวิธี plaque purification technique ซึ่งจะทำให้ได้ recombinant virus ที่บริสุทธิ์ จากนั้นทำการ ตรวจสอบว่าไวรัสที่สร้างขึ้นสามารถสังเคราะห์โปรตีน gp41 ได้โดยใช้วิธี Western blot และ indirect immunofluorescence HIV-1 gp41 vaccinia recombinant virus ที่ได้จะถูกนำมาทดสอบ CTL assay ในผู้ติดเชื้อเอช ไอวีโดยเปรียบเทียบกับ vaccinia recombinant viruses ที่มี gp160 Env gene insert : vP1536 (มี gp160 ของ CRF01_AE) และ KPS-env recombinant vaccinia virus (มี gp160 ของ HIV-1 สายพันธุ์ DA5) ผลการทดสอบพบว่าในผู้ติดเชื้อเอชไอวี 19 ราย มี 12 ราย (ร้อยละ 63.2) ที่มี CTL activity ต่อส่วน Gp160 ของทั้ง vP1536 และ KPS-env recombinant vaccinia viruses และจาก 12 รายนี้มีเพียง 6 ราย (ร้อยละ 50) เท่านั้นที่มี CTL activity ต่อส่วน gp41 จากการศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงความสำเร็จในการสร้าง HIV-1 gp41/vaccinia recombinant virus และสามารถนำไปใช้ในการทดสอบ CTL assay ในผู้ติดเชื้อเอชไอวี ซึ่งชี้ให้เห็นว่า HIV-1 gp41 vaccinia recombinant virus นี้สามารถนำไปใช้ในการทดสอบประเมินประสิทธิภาพของวัคซีน รวมถึงการนำไป ประยุกต์ใช้เป็นแอนติเจนตรวจกรองในงานวิจัยเกี่ยวกับการสร้าง monoclonal antibody อีกด้วย

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Pilaipan Puthavathana

Role: Thesis Advisors

Created: 2008

Modified: 2010-06-22

Issued: 2009-07-28

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH R942c 2008

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Microbiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4636433.pdf	2.45 MB	8	2024-03-07 14:46:32

ใช้เวลา

0.36831 วินาที