Investigation of catalytic properties of human IRE1αp in yeast model

การศึกษาคุณสมบัติการเร่งปฏิกิริยาของโปรตีน IRE1αp ของมนุษย์ภายในยีสต์

Name: Pattarawut Sopha

MeSH: RNA, Messenger

MeSH: DNA, Catalytic

MeSH: Endoplasmic Reticulum

MeSH: Fungal Proteins

MeSH: RNA Ligase (ATP)

Abstract: The unfolded protein response (UPR) is a highly conserved intracellular signaling pathway required for stress alleviation caused by unfolded protein accumulation in endoplasmic reticulum (ER) lumen. The key step for UPR activation is mediated by an unusual splicing of mRNA encoding transcription factor Hac1p that specifically binds to a 22 bp cis-acting element, UPRE in the promoter of UPR responsive genes. HAC1 RNA splicing is initiated by specific cleavage via endonuclease activity of Ire1p at its intron/exon junction. Then the exons are joined by tRNA ligase enzyme prior to being translated into a potent transcription factor. The specific seven nucleotide ring stem loop structure as well as several conserved nucleotides presented in both 5’ and 3’ splice junctions of HAC1 mRNA are essential for the splicing reaction. Using the well characterized yeast UPR as a model for elucidating the specific activity of human Ire1αp, we discovered that the homologous splicing mechanism mediated by human Ire1αp is not identical to that of yeast. Compared to the endogenous mechanism in the yeast, a more restricted nucleotide sequence at +1 position in the seven nucleotide stem loop structure at the spliced junction in the RNA substrate is pivotal for the RNA splicing mediated by Ire1αp. By in vitro cleavage assay, substitution of adenine with cytosine nucleotide at the +1 position in the stem loop of HAC1 RNA facilitated the specific cleavage of modified 3’ splice site of HAC1 RNA by hIre1αp endonuclease. Similar nucleotide restriction of the RNA substrate was observed in vivo. Coexpression of hIre1αp with mutated HAC1 using yeast strain with Ire1/hac1 null loci is capable of restoring the unconventional RNA splicing as well as the specific transcriptional up-regulation of UPR reporter gene upon ER stress whereas coexpression of hIre1αp with wild type HAC1 failed to rescue this pathway. Together these results underline the role of cytosine nucleotide at +1 of HAC1 3’ splice junction as a critical residue that determines the specificity of hIre1αp mediated mRNA splicing process.

Abstract: Unfolded protein response (UPR) เป็นกลไกการตอบสนองต่อภาวะเครียดที่เกิดจากการ สะสมของโปรตีนไม่สามารถม้วนพับได้ถูกต้องภายในเอนโดพลาสมิกเรติคิวลัม ซึ่งเป็นกลไกที่พบ ได้ตั้งแต่ยีสต์จนถึงมนุษย์ ขั้นตอนสำคัญของกลไก UPR คือการกระตุ้นกระบวนตัดต่อแบบจำเพาะ ของสารพันธุกรรมอาร์เอ็นเอ (mRNA) ที่ควบคุมการสร้างโปรตีน Hac1p โดยโปรตีนนี้จะจับอย่าง จำเพาะต่อโปรโมเตอร์ขนาด 22 คู่เบส (UPRE) เพื่อกระตุ้นการแสดงออกของยีน ซึ่งมีหน้าที่ในการ ตอบสนองต่อภาวะเครียด กลไกการตัดต่อ HAC1 mRNA เริ่มต้นจากการทำงานของ endonuclease ของ Ire1p ที่สามารถตัดสาย mRNA ที่รอยต่อระหว่าง intron กับ exon อย่างจำเพาะ จากนั้นชิ้นส่วน ของ exon จะถูกเชื่อมต่อเข้าด้วยกันโดยการทำงานของ tRNA ligase ให้อยู่ในรูปที่เหมาะแก่การเป็น แม่แบบสำหรับสร้างโปรตีน Hac1p ที่มีคุณสมบัติเป็น transcription factor กระบวนตัดต่อแบบ จำเพาะของสารพันธุกรรมอาร์เอ็นเออาศัยโครงสร้างจำเพาะแบบ stem loop ที่ประกอบด้วย 7 นิวคลี โอไทด์ loop ซึ่งปรากฏที่รอยต่อทั้งสองตำแหน่งของการตัดต่อ การศึกษานี้อาศัยกระบวนการ UPR ของยีสต์เป็นแบบจำลองเพื่อศึกษาความจำเพาะของกลไก การทำงานของ human Ire1αp ผลการทดลองพบว่ากลไก UPR ที่ใช้ hIre1αp มีความแตกต่างบาง ประการจากกลไกที่มีพบในยีสต์โดยนิวคลีโอไทด์ในตำแหน่ง +1 ของโครงสร้าง stem loop มี ความสำคัญต่อกระบวนการตัดสายอาร์เอ็นเอโดย hIre1αp การเปลี่ยนนิวคลีโอไทด์ตำแหน่งนี้จาก อดีนีนเป็นไซโตซีนนั้นส่งผลให้เกิดการตัดสายของ HAC1 อาร์เอ็นเอในหลอดทดลองโดย endonuclease ของ hIre1αp ได้นอกจากนั้นการเปลี่ยนแปลงนิวคลีโอไทด์ที่ตำแหน่งดังกล่าวยังบ่งชี้ ถึงความจำเพาะที่เกิดภายในเซลล์ด้วย จากการทดลองในยีสต์สายพันธุ์ที่ปราศจากยีน hac1 และ ire1 เมื่อถูกบังคับให้แสดงออกยีน HAC1 กลายพันธุ์และ hIre1αp พบว่าสามารถกระตุ้นให้เกิดการตัด ต่อสาย HAC1 อาร์เอ็นเอ ตลอดจนสามารถกระตุ้นการแสดงออกของยีนที่ตอบสนองต่อ UPR ด้วย ในขณะที่การบังคับให้แสดงออก HAC1 ที่ไม่กลายพันธุ์ กับ hIRE1αp นั้นไม่สามารถชดเชยกลไก ดังกล่าวภายในเซลล์ ดังนั้นผลทั้งหมดบ่งบอกถึงความสำคัญของไซโตซีนในตำแหน่ง +1 ของ stem loop ด้านรอยต่อ 3’ ว่าเป็นตัวกำหนดความจำเพาะของสายอาร์เอ็นเอต่อการตัดโดย hIre1αp

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Witoon Tirasophon

Role: Thesis Advisors

Created: 2009-07-09

Modified: 2553-06-22

Issued: 2009-07-09

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740457126

CallNumber: TH P315i 2005

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4536660.pdf	2.05 MB	10	2018-05-29 01:11:01

ใช้เวลา

-0.721418 วินาที