Heteroduplex tracking assay for the analysis of Plasmodium Falciparum genetic diversity : technique development, validation and applications

การประยุกต์ใช้เทคนิค heteroduplex tracking assay เพื่อวิเคราะห์ความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อฟัลซิปารัม มาลาเรีย

Name: Warunee Ngrenngarmlert

MeSH: Variation (Genetics)

MeSH: Heteroduplex Analysis

MeSH: Malaria, Cerebral -- diagnosis

MeSH: Recurrence

MeSH: Malaria, Cerebral -- etiology

MeSH: Plasmodium falciparum

Abstract: Plasmodium falciparum infections are frequently composed of a mixture of different strains that exhibit significant different genotypes. Three highly polymorphic genes of the merozoite surface protein 1 and 2 (MSP1 and MSP2) and the glutaminerich protein (GLURP) have always been used to genotype P. falciparum by nested polymerase chain reaction (nested PCR). Three main disadvantages of nested PCR are an inability to detect nucleotide sequence polymorphisms, a diminished sensitivity at low parasite densities, and poor resolution at high parasitemia. In this study, Heteroduplex Tracking Assay (HTA) was developed to genotype the MSP1 gene of P. falciparum. Previously determined for their allelic type by nested PCR, four DNA samples were selected for generation of four recombinant clones. The AF63, AF22, AF42 and MHP 1452 clones, which are the K1-, MAD20-, RO33-, and K1-type of the block 2 MSP1 sequences, were used as either probes and known MSP1 sequence controls in HTA. PCR with minor modifications was used to amplify the block 2 MSP1 gene. The PCR products were re-annealed with the radio labeled probes and the prominent heteroduplex bands were defined as different genotypes of P. falciparum infection. The number of these distinct bands, which is known as the multiplicity of infection (MOI), reflects the number of genotypes in each isolate. Mean of MOI determined from 39 samples was 1.92 + 0.13. Thirteen samples (33.3%) had one genotype, 18 samples (46.2%) had two genotypes, 6 samples (15.4%) had three genotypes, and 2 samples (5.1%) had four genotypes. In addition to identification of genetic diversity, HTA was also applied to distinguish recrudescence from re-infection in 17 paired admission and recrudescent samples. It was found that 10 out of 17 pairs (59%) showed true recrudescence since recrudescent samples contained identical heteroduplex bands or a subset of heteroduplex bands in the admission samples. Seven cases (41%) might have resulted from both recrudescence and re-infection because the appearances of new heteroduplex bands imply either new infection or the undetectable genotype at admission. This study is the first to apply HTA to identify genetic diversity of P. falciparum infections and also to identify recrudescence and reinfection.

Abstract: การติดเชื้อฟัลซิปารัม มาลาเรีย มักประกอบด้วยหลายสายพันธุ์ซึ่งมีความแตกต่างทางพันธุกรรม อย่างชัดเจน โดยทั่วไปความแตกต่างนี้นิยมตรวจจากยีนMSP1 MSP2 และ GLURP โดยวิธีNested PCR ซึ่งมีข้อจำกัดที่สำคัญคือ1)วิธีนี้ไม่สามารถตรวจพบความหลากหลายของลำดับนิวคลีโอไทด์ 2)ความไวของวิธีนี้ลดลงถ้าตัวอย่างมีความหนาแน่นของเชื้อน้อย และ3)เมื่อตัวอย่างมีความหนาแน่น ของเชื้อมาก วิธีนี้จะมีความละเอียดลดลง ในการศึกษาครั้งนี้ ได้ทำการพัฒนาวิธีHTAเพื่อใช้ตรวจยีน MSP1 ในเชื้อฟัลซิปารัม มาลาเรีย และทำการสร้างProbeที่มียีนMSP1ที่แตกต่างกันทั้ง 3 ชนิด วิธี HTAเริ่มจากการเพิ่มจำนวนส่วนของยีนMSP1จากตัวอย่างผู้ป่วยและนำผลผลิตนั้นมาคัดแยกโดย ใช้Probe ที่ติดฉลากด้วยสารรังสี พบว่าHeteroduplexที่แตกต่างกัน แสดงถึงความแตกต่างของยีน MSP1โดยจำนวนของHeteroduplexบ่งบอกถึงจำนวนสายพันธุ์ของเชื้อฟัลซิปารัม มาลาเรีย ในแต่ละ ตัวอย่าง ผลการศึกษาครั้งนี้พบว่า ค่าเฉลี่ยของจำนวนดังกล่าวที่ตรวจจาก 39ตัวอย่าง เท่ากับ1.92 + 0.13 ซึ่ง13จาก39รายมีเชื้อฟัลซิปารัม มาลาเรีย1สายพันธุ์ 18รายมี2สายพันธ์ 6รายมี3สายพันธุ์ และ2ราย มี4สายพันธุ์ นอกจากนี้ยังประยุกต์ใช้วิธีHTAในการวินิจฉัยแยกระหว่างการติดเชื้อซ้ำแบบ Recrudescence และแบบRe-infection พบว่าผู้ป่วย 10จาก39ราย(59 %) เป็นการติดเชื้อซ้ำแบบ Recrudescence เนื่องจากพบHeteroduplexที่เหมือนกัน แต่ผู้ป่วย 7 ราย (41%) เป็นการติดเชื้อซ้ำจากทั้ง RecrudescenceและRe-infectionเนื่องจากพบHeteroduplexที่แตกต่างกันซึ่งหมายถึง การติดเชื้อซ้ำ ของสายพันธุ์ใหม่หรือการติดเชื้อซ้ำของสายพันธุ์เดิมที่ตรวจไม่พบในระยะแรก การศึกษานี้จัดเป็นครั้ง แรกที่ประยุกต์ใช้วิธีHTAเพื่อวินิจฉัยความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อฟัลซิปารัม มาลาเรีย และ วิธีนี้ยังช่วยในการวินิจฉัยแยกระหว่างการติดเชื้อซ้ำแบบRecrudescenceและแบบRe-infection

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Wanida Ittarat

Role: Thesis Advisors

Created: 2005

Modified: 2020-04-18

Issued: 2009-07-02

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740462243

CallNumber: TH W298h 2005

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Medical Technology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4437275.pdf	1.6 MB	31	2018-05-29 01:08:01

ใช้เวลา

0.415766 วินาที