Design and analysis of lyophilized formulation for extending shelf life of Tuberculin PPD

การสร้างและวิเคราะห์สูตรตำรับของทูเบอร์คูลินพีพีดีชนิดแห้งเพื่อเพิ่มอายุในการใช้งาน

Name: Thipchuta Bharnthong

keyword: Mantoux Test

MeSH: Tuberculin Test

MeSH: Tuberculosis -- analysis

ThaSH: Tuberculosis -- diagnosis

Abstract: Tuberculin test is currently used for diagnosis and epidemiological surveys of tuberculosis. Mantoux method involves the intradermal injection of purified protein derivative (PPD) at the International unit dose. This study aimed to develop a dry PPD preparation to extend the shelf life of tuberculin PPD. Therefore, 5.0% Sucrose (S), 6.5% Mannitol (M), 2.5% Trehalose (T) and 0.3% Haemaccel (H) were added to each formulation. In vivo and in vitro analyses were carried out after lyophilization in order to determine the efficacy of the tuberculin activity. In the in vivo test, the activities of tuberculin shown by Delayed type hypersensitivity (DTH) responses to lyophilized preparations were compared to DTH responses to liquid preparation (CL) after injection into Bacillus Calmette Guerin (BCG) vaccinated guinea pigs. The results from preparations with added H, M, T, and S were 100%, 90%, 89%, and 60% of those from CL respectively. There was no loss of tuberculin activity in H formula. A statistically significant difference was found between S and CL (P <0.05). The cellular test for Interferon-gamma (IFN-γ) secretions was performed by using whole blood of human subjects screened for having DTH responses to tuberculin PPD Mantoux tests. They were assayed for Cell mediated immunity (CMI) responses caused by the stimulation of tuberculin antigens in the formulations. The detection of IFN-γ secretions was done by using Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and the efficacy was expressed in terms of percentage of IFN-γ responses to tuberculin antigens. The results of CL, H, M, T and S were 3.28%, 10.40%, 0.84%, 1.52% and 1.29% respectively. The lyophilized H, M and T formulations and the liquid CL were studied for their shelf-life stabilities. Accelerated degradation was induced by storing the samples at 4°C and higher temperatures of 37°C and 56°C for 3, 6, 9 and 12 months. All tuberculin PPD solutions were injected into BCG vaccinated guinea pigs at the end of each storage period and the activities of tuberculin were evaluated. From the graphical profile of the remaining activities and the storage times, Haemaccel was superior to the other excipients especially at the normal storage temperature of 4°C for long term of 12 months. The results demonstrate the effectiveness of Haemaccel. It provided good stability and may lead to long shelf life. This research supports the potential of development of lyophilized tuberculin PPD with the addition of 0.3% Haemaccel.

Abstract: การทดสอบการติดเชื้อวัณโรคด้วยทูเบอร์คูลินในปัจจุบันยังนิยมใช้วิธี Mantoux ที่ใช้ทูเบอร์คูลินชนิด purified protein derivative (PPD) ฉีดเข้าชั้นผิวหนังตามขนาดฉีดมาตรฐาน ซึ่งน้ำยามีความเจือจางสูงของปริมาณโปรตีน ทำให้ไม่มีความคงทน อายุของน้ำยาสั้น งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ในการพัฒนาสูตรตำรับทูเบอร์คูลิน PPD เป็นชนิดแห้งเพื่อยืดอายุการใช้งานและการเก็บรักษา โดยเติม 5.0% Sucrose (S) 6.5% Mannitol (M) 2.5% Trehalose (T) และ 0.3% Haemaccel (H) ลงในแต่ละสูตรตำรับ หลังจากผ่านกระบวนการทำแห้ง (lyophilization) ได้นำตัวอย่างของแต่ละตำรับไปวิเคราะห์ประสิทธิภาพของทูเบอร์คูลินคงเหลือ วิธีทดสอบในสัตว์ทดลองได้แก่การหาปริมาณโปรตีนในแต่ละสูตรที่สามารถกระตุ้น DTH response ซึ่งแสดงผลด้วยขนาดปฏิกิริยาที่ผิวหนังจากการฉีดตัวอย่างทูเบอร์คูลิน PPD เข้าผิวหนังหน้าท้องหนูตะเภาที่ฉีดกระตุ้นด้วยวัคซีนบีซีจีไว้แล้ว ขนาดเฉลี่ยของปฏิกิริยาตอบสนองต่อทูเบอร์คูลินชนิดแห้งแต่ละสูตรเปรียบเทียบกับขนาดของปฏิกิริยาตอบสนองต่อทูเบอร์คูลินชนิดน้ำ (CL) ได้ผลเรียงตามลำดับคือ H M T และ S เท่ากับ 100% 90% 89% และ 60% สูตร H ไม่มีการสูญเสียของปริมาณโปรตีนหลังการทำแห้ง และผลระหว่าง S และ CL มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P < 0.05) เมื่อทำการทดสอบ IFN-γ secretion จากเลือดของผู้ที่ได้รับการทดสอบแล้วว่ามี CMI response ต่อทูเบอร์คูลินด้วยวิธี Mantoux เพื่อหาปริมาณสาร IFN-γ ที่หลั่งจากการกระตุ้นเม็ดเลือดขาวด้วยทูเบอร์คูลินแอนติเจนตามปริมาณที่มีอยู่ในแต่ละสูตร พบว่าระดับ IFN-γ จากสูตร CL H M T และ S เท่ากับ 3.28% 10.40% 0.84% 1.52% และ 1.29% ตามลำดับ ซึ่งประเมินได้ว่าสูตร H สามารถกระตุ้นให้มีการหลั่งสาร IFN-γ ได้มากที่สุด การทดสอบความคงทนของ ทูเบอร์คูลินชนิดแห้งเฉพาะสูตร H M T ซึ่งมีปฏิกิริยาตอบสนองต่อทูเบอร์คูลินในหนูตะเภาไม่แตกต่างจากสูตร CL โดยวิธีวิเคราะห์ความคงสภาพของโปรตีนแบบเร่งการสลายตัวด้วยการเพิ่มอุณหภูมิและเวลา (accelerated degradation) ได้เก็บตัวอย่างของ H M T และ CL ที่ 37°C 56°C และ 4°C เป็นเวลา 3 เดือน 6 เดือน 9 เดือนและ 12 เดือน เมื่อครบแต่ละช่วงเวลาที่กำหนดได้ทดสอบหาปริมาณโปรตีนคงเหลือในแต่ละสูตรที่สามารถกระตุ้นปฏิกิริยาตอบสนองแบบ DTH ในหนูตะเภา ผลที่ได้แสดงว่าสูตร H สามารถรักษาปริมาณคงเหลือของโปรตีน PPD ได้มากกว่าสูตรอื่น โดยเฉพาะการเก็บที่ 4°C ในเวลา 12 เดือน ผลของการวิเคราะห์ตัวอย่างที่เก็บรักษาแบบปกติร่วมกับการทดสอบความคงทนแบบเร่งการสลายตัวจากงานวิจัยนี้ทำให้ประเมินได้ว่า สูตรตำรับที่มีการเติม 0.3% Haemaccel สามารถนำไปพัฒนาเป็นสูตรตำรับของทูเบอร์คูลินพีพีดีชนิดแห้งที่มีอายุการเก็บรักษาในอุณหภูมิ 4°C ได้ยาวนานกว่าสูตรอื่นและทูเบอร์คูลินชนิดน้ำ

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Virapong Prachayasittikul

Role: Thesis Advisors

Created: 2009-03-31

Modified: 2021-01-15

Issued: 2009-03-31

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9740456626

CallNumber: TH T444d 2005

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Medical Technology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4237876.pdf	2.04 MB	25	2021-04-09 16:38:51

ใช้เวลา

0.424255 วินาที