Fatty acid elongation in methylotrophic yeast Hansenula polymorpha CBS 1976 and fatty acid auxotrophic mutants

กระบวนการต่อสายยาวของกรดไขมันในเมทิลโลโทรฟิกยีสต์ Hansenula polymorpha CBS 1976 และสายพันธุ์กลายชนิดที่ต้องการกรดไขมัน

Name: Wanida Wongsumpanchai

LCSH: Fatty acids

Othors: Elongation

Othors: Methylotrophic yeast

Othors: Auxotrophic mutants

Othors: Hansenula polymorpha

Abstract: Fatty acid auxotrophic mutants (V1 to V10) of Hansenula polymorpha were isolated from the wild-type strain (leu1-1) of H. polymorpha CBS 1976 by mutagenization with ethyl methanesulfonate (EMS). All the mutants were screened as colonies which were unable to proliferate on YEPD after replication from initial YEPD containing a mixture of 1mM each of C14:0 C16:0 and C18:0 where the mutagenized cells were plated. In order to classify the mutants, their growth on media supplemented with various fatty acids of 1mM and/or 2mM C14:0 C16:0 and C18:0 were examined. Three groups of mutants possessing different phenotype were identified. The first group including six mutants (V1 to V6) did not grow on solid media supplemented with 1mM of C16:0, however, 2mM of C16:0 and 1-2mM of C18:0 could support the growth of this group. Ability of the first group which were unable to grow in 1mM C16:0 suggesting that this group of the mutants might have partially defect at the step of elongation of C16 to C18. The second group included only one mutant (V7) whose no growth when grown on media supplemented with 1mM of C14:0 and when cultivated on media supplemented with a mixture of C14:0 C16:0 and C18:0 noted that C14:0 was also increased when compared with those of the parental strain in the same media. Taken together, from these results suggesting that this mutant probably have the defect at the elongation of C14:0 to C16:0. Mutants in the third group (V8 V9 and V10) did not grow on medium cultivated with 1mM of C16:0 and 1mM of C18:0 supplementation but demonstrated their ability to proliferate on media with addition of C14:0 suggesting that this mutant might have the defect at the elongation before C14. From crosses of all the three groups of the mutants with an auxotrophic strain (ura3-1), all diploid hybrids were selected on minimal medium containing a mixture of C14:0, C16:0 and C18:0 fatty acids without uracil and MIN with uracil. The segregants of all the three groups were chosen as the recipient strain for complementation test. The diploid yeast cells were transformed with a plasmid YCpELO1.MOD harboring the coding sequences of S-ELO1 and containing the URA3 gene as a selective marker, in addition to the YCpGALELO2(U) harboring the coding sequences of S-ELO2 which containing the URA3 gene and galactose-inducible GAL promoter as a selective marker. The transformation of the yeast cells were performed using the lithium acetate method and then collected on fatty acid supplemented MIN medium. Transformation efficiency was determined by plating aliquots of transformants on the medium. Among them, only the ELO2 transformants could grow on the medium containing galactose without fatty acid supplementation. Fifteen of ~150 transformant cells designed as VT1 (URA3, FAE1) carring ELO2 were randomly chosen to further analysed the growth characteristic of VT1 transformant on solid and liquid medium containing various fatty acids related to wild-type strain. The results revealed the similar growth phenotype as found in solid and liquid medium by the growth of VT1 could reach closely to that of wild-type strain under any conditions. Moreover, comparison of chromatograms of fatty acid methyl esters (FEMEs) from the wild-type strain and VT1 mutant grown in YEPD media and YEPD supplemented with various fatty acids at 37 ํC for 24 h found that their fatty acids were similar in content and profile. Taken together, these results demonstrated that the ELO2 gene of S. cerevisiae could function in H. polymorpha V1, indicating a clear picture of the lesion in fatty acid biosynthesis in V1 mutant that the partial defect at least in the elongation step of C16 to C18. The information obtain from these studies could be exploited to create defective fatty acid elongase strains to be learnt about the mechanism of action of this yeast.

Abstract: ได้แยกสายพันธุ์กลายชนิดที่ต้องการกรดไขมัน (V1 ถึง V10) ของ Hansenula polymorpha จากการกลายพันธุ์ของ wild-type โดยใช้สารเคมี ethyl methanesulfonate (EMS) เมื่อทำการเพาะเลี้ยงสายพันธุ์กลาย พบว่า ทุกสายพันธุ์กลายที่คัดเลือกได้ไม่สามารถเจริญได้บนอาหาร YEPD หลังจากการปั๊มด้วยเพลทต้นแบบของ YEPD ที่เสริมด้วยกรดไขมันผสมของ C14:0 C16:0 และ C18:0 ที่มีความเข้มข้นอย่างละ 1 mM เพื่อที่จะจัดจำแนกกลุ่มของสายพันธุ์กลายจึงได้ทำการศึกษาการเจริญบนอาหารที่เสริมด้วย กรดไขมันชนิดต่างๆ ได้แก่ C14:0 C16:0 และ C18:0 ที่ความเข้มข้น 1 mM และ/ หรือ 2 mM ผลการศึกษาพบว่าสามารถจัดจำแนกสายพันธุ์กลายได้ 3 กลุ่ม ซึ่งมีการแสดงฟีโนไทป์ ที่ต่างกัน โดยกลุ่มที่หนึ่งมี 6 สายพันธุ์กลาย (V1 ถึง V6) ซึ่งไม่สามารถเจริญบนอาหารแข็งที่เสริมด้วย 1 mM ของ C16:0 อย่างไรก็ตาม 2 mM ของ C16:0 และ 1-2 mM ของ C18:0 สามารถช่วยเสริมการเจริญของสายพันธุ์กลายกลุ่มนี้ได้ จากผลของกลุ่มแรกที่ไม่สามารถเจริญได้ใน 1 mM ของ C16:0 แสดงว่าสายพันธุ์กลายกลุ่มนี้น่าจะมีความบกพร่องบางส่วนในขั้นตอนของการต่อสายยาวของคาร์บอนจาก C16 ถึง C18 สำหรับกลุ่มที่สอง พบว่ามีเพียง 1 สายพันธุ์กลาย (V7) ซึ่งไม่สามารถเจริญได้บนอาหารที่เสริมด้วย 1 mM ของ C14:0 และเมื่อเลี้ยงในอาหารที่เสริมด้วยกรดไขมันผสมของ C14:0 C16:0 และ C18:0 พบว่ามีการสะสมของกรดไขมัน C14:0 มากกว่า parental strain ที่เลี้ยงในอาหารสูตรเดียวกัน แสดงว่าสายพันธุ์กลายกลุ่มนี้ น่าจะมีความบกพร่องที่ขั้นตอนของการต่อสายยาวของคาร์บอนจาก C14:0 ถึง C16:0 ส่วนสายพันธุ์กลายกลุ่มสุดท้าย (V8 V9 และ V10) พบว่าไม่สามารถเจริญได้ บนอาหารที่เสริมด้วย 1 mM ของ C16:0 และ 1 mM ของ C18:0 แต่สามารถเจริญได้บนอาหารที่ต้องมี C14:0 เป็นองค์ประกอบ แสดงว่าสายพันธุ์กลายกลุ่มนี้น่าจะมีความบกพร่องที่ขั้นตอนการต่อสายยาวของคาร์บอนที่มีความยาวน้อยกว่า C14 จากการผสมสายพันธุ์ระหว่างสายพันธุ์กลายทั้งสามกลุ่มกับสายพันธุ์ที่ต้องการกรดไขมัน (ura3-1) และทำการคัดเลือกลูกผสมบนอาหาร minimal medium (MIN) ที่เสริมด้วยกรดไขมันผสมของ C14:0, C16:0 และ C18:0 แต่ไม่เติม uracil และบนอาหาร MIN ที่เติม uracil โดยลูกผสมที่ได้จากทั้งสามกลุ่มของสายพันธุ์กลายได้นำไปใช้เป็น recipient strain สำหรับขั้นตอนของการทดสอบการ complementation โดยยีสต์ลูกผสมได้ถูกทรานสฟอร์มด้วย plasmid YCpELO1.MOD ที่มีลำดับการถอดรหัสของ S-ELO1 โดยมี URA3 เป็น selective marker และ plasmid YCpGALELO2(U) ที่มีลำดับการถอดรหัสของ S-ELO2 โดยมี URA3 และ galactose-inducible GAL promoter เป็น selective marker เซลล์ยีสต์ถูกทรานสฟอร์ม โดยใช้ลิเทียม อะซิเตท และคัดเลือกบนอาหาร MIN ที่เสริมด้วยกรดไขมัน สำหรับประสิทธิภาพของการ ทรานสฟอร์มถูกวัดโดยการทำ plating aliquots ของทรานสฟอร์มเมนท์บนอาหารเลี้ยงเชื้อ จากสายพันธุ์กลายทั้งสามกลุ่ม พบว่ามีเพียง ELO2 ทรานสฟอร์มเมนท์กลุ่มเดียวที่สามารถเจริญได้บนอาหารที่ไม่เสริมกรดไขมัน แต่ใส่ galactose โดยประมาณ 15 จาก 150 ทรานสฟอร์มเมนท์ออกแแบบเป็น VT1 (URA3, FAEI) ที่มี ELO2 ถูกคัดเลือกแบบสุ่มเพื่อนำไปใช้ศึกษาลักษณะการเจริญของทรานสฟอร์มเมนท์ VT1 บนอาหารแข็งและอาหารเหลวที่เสริมด้วยกรดไขมันชนิดต่าง ๆ เปรียบเทียบกับลักษณะการเจริญของ wild-type ผลการศึกษาในทุกสภาวะของการทดลองพบว่า VT1 มีลักษณะของการเจริญที่พบทั้งในอาหารแข็งและอาหารเหลว คล้ายกับการเจริญของ wild-type นอกจากนี้ จากการเปรียบเทียบโครมาโตแกรมของ fatty acid methyl esters (FAMEs) ของ wild-type และ VT1 ที่เจริญบนอาหาร YEPD และ YEPD ที่เสริมด้วยกรดไขมันชนิดต่าง ๆ จากการเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง พบว่ามีปริมาณและสัดส่วนของกรดไขมันต่าง ๆ คล้ายคลึงกัน สำหรับผลการศึกษาที่กล่าวมาแสดงให้เห็นว่า ELO2 ของ S. cerevisiae สามารถชดเชยส่วนที่บกพร่องของสายพันธุ์กลาย V1 ของ H. polymorpha ได้ ซึ่งแสดงให้เห็นว่ามีความบกพร่องของกระบวนการผลิตกรดไขมันในสายพันธุ์กลาย V1 โดยพบว่ามีความบกพร่องบางส่วนอย่างน้อยคือในขั้นตอนของการต่อสายยาวของคาร์บอน จาก C16 ถึง C18 นอกจากนี้ข้อมูลที่ได้จากการศึกษานี้สามารถนำไปใช้ในการศึกษาสายพันธุ์กลายชนิดที่มีความบกพร่องตรง elongase เพื่อมุ่งสู่ความรู้ความเข้าใจเกี่ยวกับวิถีเมตโบลิซึมในยีสต์นี้

Chulalongkorn University

Address: กรุงเทพมหานคร (Bangkok)

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Amorn Petsom

Role: Advisor

Name: Sarintip Anamnart

Role: Advisor

Created: 2004

Issued: 2006-03-04

Modified: 2006-09-01

วิทยานิพนธ์/Thesis

URL: http://thailis-db.car.chula.ac.th/CU_DC/Thesis/March2006_1/Wanida.pdf

ISBN: 9741759134

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Wanida.pdf	2.46 MB	27	2025-01-21 18:31:15

ใช้เวลา

0.039081 วินาที