Selection of TnAraOut mutants from nitrogen-fixing and heat tolerant Sinorhizobium fredii S174

การคัดเลือกมิวแทนต์ TnAraOut จาก Sinorhizobium Fredii S174 ที่ตรึงไนโตรเจนและทนร้อน

Name: Somchoke Kala

LCSH: TnAraOut mutant

LCSH: Mutation (Biology)

LCSH: Nitrogen-fixing microorganisms

LCSH: Sinorhizobium fredii

Abstract: Sinorhizobium fredii is a fast growing nitrogen-fixing heat tolerant bacterium in soybean root nodules with doubling time less than 6 hours. Another category of soybean rhizobia is a slow-growing Bradyrhizobium japonicum with doubling time more than 6 hours. The aims of the experiments are to isolate slow-growing TnAraOut mutants from fast-growing nitrogen-fixing and heat tolerant S. fredii S174 by biparental mating between S. fredii S174 and E. coli S17-1[lambda]pir (pNJ17). TnAraOut is a transposon on the plasmid pNJ17 with arabinose-inducible promoter (P[subscript BAD]), araC and kanamycin resistant gene. The transposon inserts in the TATA region of -10/-35 promoters rendering the promoters to be arabinose-inducible. Mutants with cell division gene promoter disruption grew normally and yielded large colonies in the presence of arabinose. They grew slowly resulting in small colonies when arabinose was not in the medium. Confirmation of the presence of TnAraOut in the mutant genomes was carried out by digesting each mutants DNA with SphI, recircularization, then electroporation into E. coli DH5[alpha][lambda]pir and selection for kanamycin resistant colonies. DNA of each kanamycin-resistant colony was isolated and used as target DNA for PCR with P[subscript BADout2] as the primer. PCR products were sequenced for the presence of an inverted repeat sequence of TnAraOut. Experimental results revealed the first full 16S rDNA sequence of S. fredii S174 (1457 nucleotides). In addition, fifteen TnAraOut mutants were obtained. Two TnAraOut mutants (ST49 and ST60) were used to prove the presence of TnAraOut sequence in their genomes. Experimental results revealed the presence of the insertion sequence in the TATA region of the promoters of the mutants. In addition, thermotolerance properties of TnAraOut mutants ST49 and ST60 were found to be comparable to that of the wild type. SDSPAGE of intracellular proteins of cells grown under high temperatures indicated similar protein profiles with increased synthesis of polypeptides 10, 12, 60, and 62 kDa. Nitrogen fixing potential of TnAraOut mutant ST60 was found to be comparable to that of the wild type when Glycine max cultivar SJ4 was used as the soybean host

Abstract: Sinorhizobium fredii เป็นแบคทีเรียตรึงไนโตรเจนและทนร้อนที่มีอัตราการเพิ่มจำนวนเร็ว (เวลาที่ใช้ในการเพิ่มจำนวนเซลล์เป็นสองเท่า น้อยกว่า 6 ชั่วโมง) พบในปมรากถั่วเหลือง แบคทีเรียตรึงไนโตรเจนในปมรากถั่วเหลืองอีกประเภทหนึ่งได้แก่ Bradyrhizobium japonicum มีการเพิ่มจำนวนช้า (เวลาที่ใช้ในการเพิ่มจำนวนเซลล์เป็นสองเท่ามากกว่า 6 ชั่วโมง) วัตถุประสงค์ของการทดลอง เพื่อแยกมิวแทนต์ที่เพิ่มจำนวนช้าจาก S. fredii S174 ที่ตรึงไนโตรเจนและทนร้อน โดยทำ biparental mating ระหว่าง S. fredii S174 และ E. coli S17-1[lambda]pir (pNJ17) TnAraOut เป็นทรานสโปซอน บนพลาสมิด pNJ17 ซึ่งประกอบด้วย โพรโมเตอร์ที่ใช้อราบิโนสในการเหนี่ยวนำ (P[subscript BAD]), ยีน araC และยีนระบบการดื้อยากานามัยซิน ทรานสโปซอน TnAraOut จะแทรกเข้าบริเวณ TATA ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของ -10/-35 โพรโมเตอร์ทำให้โพรโมเตอร์นั้นๆ กลายเป็น โพรโมเตอร์ที่ต้องใช้อราบิโนสในการเหนี่ยวนำ (P[subscript BAD]) ดังนั้นถ้าเลี้ยงมิวแทนต์ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีอราบิโนส เซลล์จะเพิ่มจำนวนเร็ว ทำให้ได้โคโลนีขนาดใหญ่ แต่เมื่อเลี้ยงมิวแทนต์ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่มีอราบิโนส เซลล์จะเพิ่มจำนวนช้า ทำให้ได้โคโลนีขนาดเล็ก พิสูจน์การมี TnAraout แทรกในโครโมโซมของมิวแทนต์ โดยตัดดีเอ็นเอของมิวแทนต์ด้วย เรสทริกชั่นแอนไซม์ Sphl ทำชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ที่ได้ให้เป็นวงกลม หลังจากนั้น อิเลคโตรพอเรต เข้าไปในเซลล์ของ E. coli DH5[alpha][lambda]pir แยกโครโมโซมของโคโลนีที่ดื้อยากานามัยซินและใช้เป็น target DNA ในการทำ PCR โดยใช้ไพรเมอร์ซึ่งอยู่บนพลาสมิด pNJ17 ได้แก่ P[BADout2] ซึ่งเป็นลำดับนิวคลีโอไทด์ส่วนหนึ่งของโพรโมเตอร์ที่ต้องใช้อราบิโนสในการเหนี่ยวนำ ผลการทดลองพบลำดับนิวคลีโอไทด์ (1457 นิวคลีโอไทด์) ซึ่งเป็นรายงานครั้งแรกสำหรับลำดับนิวคลีโอไทด์ของ 16S rDNA ของ S. fredii S174 นอกจากนี้ได้แยกมิวแทนต์ 15 ชนิด นำมิวแทนต์ 2 ชนิด ได้แก่ ST49 และ ST60 มาพิสูจน์การมีชิ้นส่วน TnAraOut แทรกในโครโมโซม ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่ามีการแทรกของ TnAraOut เข้าไปในบริเวณ TATA ของโพรโมเตอร์ใน TnAraOut มิวแทนต์ นอกจากนี้ TnAraOut มิวแทนต์ ST49 และ ST60 มีสมบัติการทนร้อนเทียบเท่ากับสมบัติการทนร้อนของ wild type S. fredii S174 โดยมีโปรตีนโพรไฟด์ของเซลล์ที่เลี้ยง ณ อุณหภูมิสูงคล้ายกัน พบการสร้างพอลิเปปไทด์ 10, 12, 60 และ 62 กิโลดาลตัน เพิ่มขึ้น สมบัติการตรึงไนโตรเจนของ TnAraOut มิวแทนต์ ST60 เทียบเท่ากับสมบัติของ wild type S. fredii S174 เมื่อใช้ถั่วเหลือง Glycine max พันธุ์ สจ 4 เป็นถั่วเหลืองในการเหนี่ยวนำให้สร้างปม

Chulalongkorn University

Address: กรุงเทพมหานคร (Bangkok)

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Kanjana Chansa-ngavej

Role: Advisor

Created: 2004

Issued: 2006-02-27

Modified: 2006-08-15

วิทยานิพนธ์/Thesis

URL: http://thailis-db.car.chula.ac.th/CU_DC/Thesis/February2006/Somchoke.pdf

ISBN: 9745321974

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Industrial Microbiology

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Somchoke.pdf	13.13 MB	20	2024-07-10 13:48:37

ใช้เวลา

0.031198 วินาที